于定国从小就向他父亲学习法律，父亲去世后，于定国任过狱吏、郡府决曹，再后来补为廷尉史，通过选拔，与御史中丞一起处理谋反案。因能力强，被举荐为侍御史，又升任御史中丞。昭帝驾崩，昌邑王到长安继承皇位，行为淫乱，于定国上书劝谏，后来昌邑王被废黜。宣帝即位，大将军霍光兼领尚书事务，凡是劝谏过昌邑王的大臣都得到提拔，于定国被任命为光禄大夫，负责尚书事务，受到重用。几年后，转任水衡都尉，升任廷尉。

　　于定国于是拜师学习《春秋》，手执经书，北面行弟子之礼。他为人谦逊、恭谨，尤其敬重精通经书的士人，即使是身份卑微，徒步前来拜访的人，他都以礼相待，毕恭毕敬，受到士人的交口称赞。于定国始终坚持父亲的理念秉公办案，特别体恤鳏寡孤独的穷人，不是特别肯定的犯罪，都尽量从轻发落，审理案情，特别谨慎，保证不造成一起冤案。朝野都称赞说：“张释之为廷尉，天下无冤民；于定国为廷尉，民自以为不冤。”于定国与张释之被称为汉代司法“双子星”，是后世“司法公正”的典范。

　　于定国的酒量特别好，连喝数石都不会醉，而且喝完脑子更加清醒。冬天受理冤案申诉，他经常边喝酒边审案，判决结果一清二楚。于定国在廷尉任上一干就是18年，后来升任御史大夫。

　　甘露年间，于定国继黄霸之后担任丞相，受封为西平侯。三年后，宣帝驾崩，元帝即位。元帝对于定国等前朝老臣都特别敬重，当时陈万年担任御史大夫，与于定国同朝共事八年，两人在廷议时意见都很统一。后来贡禹继任御史大夫，在廷议时经常与于定国意见相左，由于于定国熟悉朝中政务，元帝往往认可于定国的意见。

　　但汉朝的丞相可不是好当的，因为当时特别相信䜟纬。元帝刚刚即位不久，关东就连年发生灾害，百姓流离失所，大批灾民涌入关内。有人上书皇上把责任推到朝中大臣身上，元帝于是多次召见丞相、御史大夫，进宫受诏，逐条用职务责备他们说：“下面官吏放任盗贼，致使无辜百姓蒙冤而死；有些地方官吏不去追捕盗贼，反而抓捕受害者，受害者家人不敢告状，案件长期得不到处理；百姓蒙受冤屈，州郡不理会，百姓只好上书求助于朝廷；两千石官员举荐不实，有很多人不称职；百姓的庄稼受灾，官吏不闻不问，反而催缴赋税，百姓陷入困境。关东的流民饥寒交迫，疾病流行，已经下诏官吏开仓放粮，赐发御寒冬衣，这些措施恐怕不能维持到春天。丞相、御史你们打算怎样弥补这些过错呢？你们都要认真地分条陈述这些过失。”于定国于是上书谢罪。

　　永光元年，春天降霜，夏季寒冷，太阳昏暗无光，元帝又下诏责备于定国说：“听关东来的郎官说，民间已有父子相弃的情况，你们为何隐瞒不报？我要了解真实情况，今年岁末的收成还尚难预料，一旦有水旱之灾，朝中公卿是否能拿出预案？对已出现的问题，是否有可行的解决方法？要认真对待，不要隐瞒。”于定国感到手足无措，上书自责，并请求归还侯印，乞骸骨退休。元帝回复说：“您作为丞相，总揽国家政事，一向兢兢业业。人非圣贤，孰能无过。现在阴阳不调，灾祸出现，不是单一原因造成的。即使圣人在世，问题也要逐项解决，不能归纳为一个原因。经书讲‘万方有罪，罪在朕躬。’您何必把责任都揽在自己身上，请您继续主持国家大政，力求用尽您的聪明才智，您要努力进食，注意身体健康。”

　　于定国又上书说病情加重，坚决要求辞官还乡。元帝只好赐给他安车驷马、黄金60斤，批准他退休。几年后，于定国在家中去世，享年70多岁，谥号为安侯。

　　于定国的嗣子于永继承了爵位，于永年少时，因为酗酒经常闯祸。到了30岁才知道改过自新，因为父亲的的职务，在朝中担任侍中兼中郎将、长水校尉。于定国去世后，于永在家中居丧，遵循礼仪，以孝行闻明。后来以列侯身份担任散骑光禄勋，又升任御史大夫。馆陶公主刘施是宣帝的长女，成帝的姑妈，很贤惠，行为端庄，于永在很多人中被选为驸马。成帝正打算任命于永为丞相，于永却因病去世。

　　于永的嗣子于恬继承爵位，于恬不像祖父和父亲那样贤能，没有什么值得称道的行为。

　　于定国是西汉司法史上的一座丰碑，他以宽平仁恕、审慎公正的司法实践，为宣帝朝的中兴奠定了法制基础，成为后世司法官员的楷模。但他作为丞相，在治国理政上缺乏突破性，未能显著影响元帝时期宦官外戚专权的政局，政治影响力有限。