固相肽合成（SPPS）全面解析

　　一、核心原理：如何在固相上逐步构建肽链？

　　固相肽合成的核心原理由布鲁斯·梅里菲尔德（R. Bruce Merrifield）于1963年提出，并因此获得1984年诺贝尔化学奖。其核心思想是：将第一个氨基酸的C端通过共价键固定在一个不溶性的固相载体（树脂）上，然后在此氨基酸的N端依次连接下一个被保护的氨基酸，经过反复的脱保护-偶联循环，最终合成目标肽链。合成完成后，将完整的肽链从树脂上切割下来，并进行纯化。

　　固相载体（Solid Support）：提供了一个反应和纯化的平台。所有反应在树脂上进行，过量的试剂和副产物只需通过简单的过滤和洗涤即可除去，极大地简化了纯化步骤，实现了合成的自动化。

　　保护基策略（Protecting Group Strategy）：

　　临时保护基（Temporary Protecting Group）：保护正在参与反应的氨基酸的α-氨基。在每个偶联循环前被移除，以暴露出游离的氨基与下一个氨基酸反应。最常用的是Fmoc（9-芴基甲氧羰基）和 Boc（叔丁氧羰基）。

　　永久保护基（Permanent Protecting Group）：保护氨基酸侧链上的活性基团（如Lys的ε-氨基，Asp/Glu的羧基，Cys的巯基等），防止它们在合成过程中发生副反应。在最终肽链从树脂上切割时被同时移除。选择取决于临时保护基和切割条件。

　　循环合成（Cyclic Synthesis）：每个氨基酸的引入都遵循一个标准循环：

　　脱保护（Deprotection）：移除当前树脂末端氨基酸的临时保护基，暴露出游离α-氨基。

　　洗涤（Washing）：洗去脱保护试剂和副产物。

　　偶联（Coupling）：下一个被保护的氨基酸单体（其羧基已被活化）与树脂上的游离氨基反应，形成酰胺键（肽键）。

　　洗涤（Washing）：洗去过量的氨基酸单体和偶联试剂。

　　最终切割与脱保护（Cleavage & Global Deprotection）：循环完成后，使用强酸（如TFA）处理树脂，一方面切断肽链与树脂之间的连接键，另一方面移除所有氨基酸侧链上的永久保护基，释放出粗肽。

　　二、关键知识与化学方法

　　两大主流策略：

　　Boc/Bzl策略：

　　临时保护基：Boc（用TFA/二氯甲烷脱除）。

　　永久保护基：苄醇类（Bzl）保护基（用强酸如HF或TFMSA切割）。

　　特点：需要较强的切割条件，对酸敏感肽不友好，但历史悠久，非常成熟。

　　Fmoc/t-Bu策略：

　　临时保护基：Fmoc（用哌啶/DMF脱除，碱性条件）。

　　永久保护基：叔丁基（t-Bu）等（用TFA切割，酸性条件）。

　　特点：目前最主流的策略。采用正交保护（酸/碱条件互不干扰），切割条件相对温和（TFA即可），更适合合成复杂修饰肽和酸敏感肽。

　　树脂（固相载体）：

　　材料：交联聚苯乙烯（PS）、聚乙二醇嫁接的聚苯乙烯（Tentagel， PEG-PS）、聚丙烯酰胺（Pepsyn）等。

　　连接 linker：连接第一个氨基酸和树脂的分子，其结构决定了最终的切割条件和肽的C端官能团。

　　Wang Resin：用于Fmoc策略，TFA切割后得到羧酸端。

　　Rink Amide Resin：用于Fmoc策略，TFA切割后得到酰胺端（CONH₂）。

　　2-Chlorotrityl Chloride (CTC) Resin：非常酸敏感的树脂，用于Fmoc策略，可用极低浓度的TFA（如1%）切割，适合合成侧链极度酸敏感的肽段。

　　偶联化学（Coupling Chemistry）：

　　活化机制：为了让羧基更容易与氨基反应，需要将其活化形成高活性的中间体。

　　常用缩合剂：

　　碳二亚胺类：DIC（N，N'-二异丙基碳二亚胺）、DCC（N，N'-二环己基碳二亚胺）。常与添加剂（如HOBt（1-羟基苯并三唑）、HOAt（7-氮杂-1-羟基苯并三唑））联用，以减少外消旋化和提高效率。

　　鎓盐类：HBTU/HATU/HCTU等。HATU是目前效率最高、速度最快的缩合剂之一，尤其适用于困难序列。

　　磷鎓盐类：PyBOP， PyAOP。

　　预活化单体：为了节省时间和提高效率，有时会预先将氨基酸和缩合剂制成更稳定的活性酯形式，如Oxyma系列。

　　困难序列（Difficult Sequences）：

　　问题：在合成某些肽段时，由于已合成部分形成的二级结构（如β-折叠片），阻碍了下一个氨基酸的有效偶联，导致截断肽和缺失肽的产生。

　　解决方案：

　　提高偶联效率：使用更强效的缩合剂（如HATU）、双重偶联、提高反应温度、微波辅助合成。

　　破坏二级结构：在主链上引入伪脯氨酸、使用具有更强溶剂化能力的溶剂（如DMF中加DMSO或NMP）、采用具有更强空间位阻的临时保护基（如Dde）。

　　三、算法结构与流程（合成设计与优化）

　　SPPS本身是一个化学过程，但其设计、优化和控制严重依赖算法和软件。

　　合成设计算法（上游）：

　　输入：目标氨基酸序列。

　　算法流程：

　　保护基选择：根据目标肽的序列和最终所需的修饰（C端、侧链），自动选择最优的保护基策略（Fmoc-tBu vs Boc-Bzl）并为每个氨基酸的侧链分配合适的永久保护基（如Lys(Boc)， Asp(OtBu)， Cys(Trt)）。

　　树脂选择：根据C端需求（-COOH，-CONH₂，-CH₂NH₂等）自动推荐最合适的树脂和连接臂。

　　偶联策略优化：识别序列中的“困难位点”（如Val， Ile， Val-Val， Ile-Ile等），并为其推荐更强的偶联条件（如使用HATU代替HBTU，延长反应时间，双重偶联）。

　　计算试剂用量：根据树脂载量（loading）和反应规模，精确计算每个循环所需氨基酸单体、缩合剂、脱保护试剂的摩尔量和体积。

　　输出：一份详细的、可执行的合成方案（SOP），包括所有试剂的配置方法、每个循环的反应时间、温度等参数。

　　代表软件：Biotage Prioria， CEM PepDriver， CSBio Symphony软件。

　　过程控制与监测算法（下游）：

　　实时监测：现代合成仪可集成在线监测技术，如：

　　光电导率监测：实时监测脱保护（哌啶浓度）和偶联（反应完成）过程，确保每一步反应完全。

　　光谱监测：使用UV或NIR光谱监测Fmoc脱除时产生的芴类衍生物，以判断反应终点。

　　反馈控制：算法根据监测数据动态调整反应参数。例如，如果监测到某一步脱保护不完全，系统可自动延长脱保护时间或进行第二次脱保护。

　　四、设备（硬件）

　　手动合成系统：玻璃反应器、摇床、抽滤装置。用于小规模探索和研究。

　　自动肽合成仪（Automated Peptide Synthesizer）：

　　核心部件：

　　反应器：容纳树脂并进行反应的容器，通常带有筛板和搅拌/鼓泡系统。

　　试剂分配系统：高精度的液体处理器、阀门和泵，用于准确输送溶剂、氨基酸溶液、缩合剂等。

　　废液收集系统。

　　控制系统：计算机或嵌入式系统，用于运行合成程序和控制硬件。

　　类型：

　　基于烧杯（Beckman）：传统方式，搅拌混合。

　　基于柱式（Column-based）：更常见，通过从底部通入氮气鼓泡进行混合。

　　主流厂商：CEM (Liberty系列)， Biotage (Syro系列)， Gyros Protein Technologies (Prelude系列)， CSBio等。

　　微波辅助合成仪：如CEM Liberty Blue。通过微波加热极大加速偶联和脱保护反应速率（从数十分钟缩短到几分钟），并能提高困难序列的偶联效率，是现代高通量肽合成的关键技术。

　　五、发展前景

　　更长、更复杂的肽和蛋白质：通过改进的连接剂（如KAHA连接、Native Chemical Ligation）和修饰技术，SPPS正在突破其传统极限（~50个氨基酸），用于合成更长的肽段甚至小蛋白质。

　　环肽和特殊修饰肽：发展新的化学方法来高效合成头尾环肽、侧链环肽、以及含有磷酸化、糖基化、脂化等复杂翻译后修饰的肽。

　　高通量与自动化：自动化合成仪将更加智能和高效，能够并行合成多个肽序列，满足药物发现中大规模肽库构建的需求。

　　连续流固相合成（Continuous-Flow SPPS）：将树脂填充在柱中，试剂连续通过柱子进行反应，有望进一步提高合成效率、减少试剂消耗并实现更精确的控制。

　　六、与人工智能技术的结合

　　AI正在渗透到SPPS的每一个环节，从“设计”到“执行”再到“分析”。

　　序列设计与优化：

　　属性预测：使用机器学习模型（如基于RNN或Transformer的模型）根据氨基酸序列预测肽的物理化学性质（如溶解性、疏水性）、生物活性和合成难度。这可以在合成之前筛选出有前景且易于合成的候选分子。

　　逆合成设计：AI可以学习海量的合成数据，为给定的目标肽推荐最优的保护基组合、树脂和连接臂，避免手工设计的疏漏。

　　预测与克服困难序列：

　　机器学习模型：通过训练已知的“困难序列”及其解决方案（如使用伪脯氨酸、特定溶剂、提高温度等）的数据集，AI模型可以提前预测目标序列中哪些位点可能存在问题，并推荐最佳的规避策略，从而一次性获得高纯度的粗肽。

　　过程控制与优化：

　　强化学习（Reinforcement Learning）：AI可以控制合成仪，将其视为一个环境。通过不断尝试不同的反应参数（如温度、时间、试剂浓度）并接收“产率”和“纯度”作为奖励，AI可以自主学习出一套针对特定序列的最优合成参数，甚至超越人类专家的经验。

　　预测性维护：AI分析合成仪传感器数据，预测泵、阀门等部件的故障，减少停机时间。

　　纯化与分析：

　　色谱预测：AI可以根据肽的序列预测其在反相HPLC上的保留时间，从而大幅缩短方法开发时间，快速确定最佳纯化梯度。

　　质谱解析：深度学习算法可以更快速、更准确地解析肽的质谱图，确认其分子量和序列，并鉴定常见的副产物（如缺失肽、删除肽）。

　　总结：固相肽合成已经从一门纯粹依赖于有机化学经验的“手艺”，发展成为一门高度跨学科的、由化学、工程学和人工智能共同驱动的现代科学技术。AI的深度融合正在使其变得更加预测性、自动化和智能化，极大地加速了从肽的“序列设计”到“高质量成品”的整个流程，为新药研发、诊断试剂和材料科学提供了强大的工具。